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乳酸杆菌属特异性引物鉴定的分析和展望
北纳生物 2018-12-17

肠球菌

<肠球菌>

人体乳酸杆菌的存在及其数量,往往被看作身体健康的“晴雨表”。在定量过程中引物不可缺少,本实验经过理论分析初筛和琼脂糖凝胶试验筛选出1对特异性较好的乳酸杆菌属特异性引物,命名为Lab-F1/Lab-R1(Lab1)。随后将Lab1作为EvaGreen ddPCR扩增的引物,借助QX200 Droplet Digital PCR系统依次对引物进行了特异性、灵敏性和有效性检验,结果发现这对引物不仅具有较好的特异性和灵敏性,还可以用来有效定量粪便中的乳酸杆菌。

乳酸杆菌引物设计是基于其特有的序列设计引物,这种所谓的特有序列是针对目前已知的序列,而未知的序列难以预测,这就导致实际应用中难以保证其特异性,尤其是复杂样品中乳酸杆菌的检测。Byun等以35种乳酸杆菌的16S rRNA基因序列为参考设计的乳酸杆菌属引物,可以对龋齿中存在的乳酸杆菌进行定量分析,Delroisse等设计的乳酸杆菌属引物可以扩增大鼠粪便中的15种乳酸杆菌,Heilig等分析肠道微生物多样性所用的乳酸杆菌属引物一条是基于乳酸杆菌属设计,另一条引物却可以扩增出乳酸杆菌属和肠球菌属,还有Isabel等设计的乳酸菌引物可以同时扩增出乳酸杆菌属、链球菌属、片球菌属和乳球菌属,而Walter等设计的引物可以同时扩增出乳酸杆菌属、片球菌属、明串球菌属和魏斯氏菌属。

这些引物往往都有其最佳使用环境,或者扩大了检测范围,然而,目前很难设计一对引物可以特异性地扩增出所有乳酸杆菌。无论是重新设计乳酸杆菌属引物,还是参考文献中提供的引物,都存在不可避免的缺陷,而本文成功地通过先理论筛选后试验验证的方法筛选出适合检测粪便中乳酸杆菌的特异性乳酸杆菌属引物,进而证明这种理论与实验结合的引物筛选的方法是可行的。

由于乳酸杆菌是非单系起源、且与其他乳酸菌基因序列具有高度相似性,本试验以16株标准菌株为模板进行引物特异性验证时,Lab1这对引物不仅扩增出了所有乳酸杆菌,还扩增出了魏斯氏菌和片球菌。根据目前粪便微生物多样性分析发现,粪便中的片球菌和魏斯氏菌属相对含量比较低,基本检测不到,往往不做微观研究,这就减少了定量过程中对乳酸杆菌属真实含量的影响。同时,通过NCBI网站查询片球菌和乳酸杆菌属全基因组信息可以发现,片球菌的G+C含量普遍较乳酸杆菌属的低,定量乳酸杆菌属时,可适当将退火温度提高,以提高引物的特异性。此外寻找乳酸杆菌属特有的基因序列,如核心基因等,作为靶序列设计属水平特异性引物也许是引物设计的一条新途径。

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