文化长廊

乳酸杆菌属特异性引物鉴定的材料和方法
北纳生物 2018-12-07

菌种

<菌种>

1材料和方法

1.1主要菌株及DNA提取

本试验用来检验引物特异性的16株细菌,包含14株模式菌株和2株非模式菌株,均由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供,具体信息如表1。利用天根生化科技(北京)有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取,具体方法参照说明书进行。

1.2乳酸杆菌属16S rRNA基因序列的查找及引物的搜索

下载219种乳酸杆菌16S rRNA基因序列,汇成基因序列集。通过查阅文献搜索已有乳酸杆菌属和包含乳酸杆菌属的引物。将搜索到的引物借助MEGA 6.0以Lactobacillus salivarius的16S rRNA基因序列为模板(Accession number:AF089108.2)进行比对,确定每条引物的起始位置。

1.3乳酸杆菌属引物的特异性试验

将搜索到的12对乳酸杆菌属引物,以表1中的16个亲缘相近种为模板,根据文中提到的最佳退火温度进行PCR扩增,利用琼脂糖凝胶检验其特异性。PCR反应体系、DNA Marker和核酸染料均购自大连宝生物技术有限公司;电泳仪(DYY-6D型)购自北京六一生物科技有限公司,凝胶成像仪(GDS-8000)购自美国UVP公司。

1.4引物与乳酸杆菌属及其相近属的匹配率分析

借助MEGA 6.0软件,将引物与乳酸杆菌属16S rRNA基因序列集及乳酸杆菌属相近的6个菌属(肠球菌属、乳球菌属、肠膜明串珠菌属、魏斯氏菌属、链球菌属和片球菌属)的16S rRNA基因序列进行比对,查看其与乳酸杆菌属及其相近属的匹配率(匹配率即与比对序列完全匹配的引物序列数/16S rRNA基因序列数)。比对时,正向引物的序列不变,反相引物的序列反相碱基互补。

1.5乳酸杆菌属特异性引物筛选

以表2为依据,挑选:(1)只与乳酸杆菌属匹配的单条引物,(2)与其他菌属匹配但其匹配率远远低于乳酸杆菌属的引物,(3)与乳酸杆菌属和片球菌属匹配的引物,(4)与乳酸杆菌属、片球菌属和魏斯氏菌属匹配的引物。引物扩增子太短不仅很难与可能存在的二聚体区分,而且会影响引物扩增的特异性,而扩增子太长引物的扩增效率较短扩增子的低且扩增速率降低[13],因此本实验组合已经筛选出的引物单链,使引物的扩增产物片段大小介于100-300 bp。再借助MEGA 6.0比对引物3′端与乳酸杆菌属16S rRNA基因序列的匹配情况,挑选3′端与乳酸杆菌属16S rRNA序列完全匹配的引物。最后将符合上述所有条件的引物根据引物自身情况将序列做适当调整。

1.6引物的特异性验证

将经筛选、组合和调整的引物,以乳酸杆菌亲缘相近的16株菌为模板,退火温度60℃,采用1.0%琼脂糖电泳对PCR扩增产物特异性进行检测,并用凝胶成像仪观察检测结果。

1.7微滴式数字PCR反应

将2μL DNA、上下游引物各0.2μL、10.0μL 2×ddPCR SuperMix和7.6μL的灭菌超纯水混合,制备成ddPCR反应液。将ddPCR反应液与微滴生成油分别加至微滴发生卡的对应孔,放入微滴生成仪(反应所用试剂均购自美国Bio-Rad公司)。使用EvaGreen程序进行PCR扩增,退火温度60℃。将PCR扩增后的96孔板置于微滴分析仪进行检测和分析。

1.8乳酸杆菌属引物在数字PCR定量中的应用

借助QX200 Droplet Digital PCR系统(美国Bio-Rad公司),使用EvaGreen进行PCR扩增,退火温度60℃,对引物Lab-F1/Lab-R1依次进行如下试验:(1)依次以L.salivarius、W.beninensis、P.acidilactici、L.psedomesenteroides、S.thermophilus、L.plantarum和灭菌超纯水为扩增模板,检验引物Lab-F1/Lab-R1的特异性;(2)将L.salivarius的DNA稀释液按10倍梯度依次稀释,检验Lab-F1/Lab-R1的灵敏性;(3)以Lab-F1/Lab-R1为引物,对不同的粪便中的乳酸杆菌进行检测。

相关推荐:

乳酸杆菌分离鉴定技术的研究(二)

分布在三种乳酸杆菌中的Rib类似蛋白的总结

实验室菌株保存方法

上一篇:细菌生物膜的特点及其形成过程!

下一篇:酪酸梭状芽孢杆菌的作用机制

0

BeNa Culture Collection  |  北纳创联  |  bncc.org.cn