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乳酸杆菌属特异性引物鉴定
北纳生物 2018-12-04

乳酸杆菌

<乳酸杆菌>

原标题:肠道中乳酸杆菌属特异性定量引物的筛选及验证

白晓晔,钟智,孙志宏,张和平

摘要:[目的] 乳酸杆菌与人和动物的健康有密切关系,它的存在及含量变化可以作为评价宿主健康的指标之一。在乳酸杆菌定量研究中,特异性引物往往是定量成功的关键。然而,已有引物质量参差不齐,难以保证其特异性。本文旨在通过理论与试验的方法快速筛选出用于定量的乳酸杆菌属特异性引物,同时为今后引物筛选和设计提供理论基础。[方法] 查阅文献、挑选出12对基于16S rRNA基因序列设计的乳酸杆菌属引物,通过MEGA 6.0软件确定引物相对位置,计算引物匹配率,以引物相对位置和匹配率为依据重新组合引物,获得理论特异性乳酸杆菌属引物,再通过琼脂糖凝胶电泳和QX200 Droplet Digital PCR系统对新组合引物的特异性进行检验。[结果] 通过理论与试验相结合的方法确定了一对特异性较好的乳酸杆菌属定量引物Lab1,它的扩增产物大小约300 bp。ddPCR系统检验结果发现其特异性和灵敏性较好,还可以有效定量粪便中的乳酸杆菌。[结论] 引物设计理论结合特异性试验这种方法可以快速有效地筛选出特异性较好的引物,同时为今后引物筛选和设计提供理论基础。

乳酸杆菌是兼性厌氧、无芽孢、生产乳酸的革兰氏阳性杆菌,它们是口腔、胃肠道和女性泌尿生殖道中的常见微生物。乳酸杆菌通常被认为是非致病细菌,一些菌株还被用作益生菌以预防和治疗某些疾病。乳酸杆菌与人和动物关系密切,常用它的含量变化作为健康与否的“风向标”。刘茜明等应用q-PCR方法对葛根芩连汤治疗前后的巴马猪抗生素性腹泻动物模型肠道内乳酸杆菌数量的动态变化进行定量比较分析,发现葛根芩连汤治疗组的各肠段中乳酸杆菌属菌群含量呈显著上升趋势,对照组的含量显著下降,进而证明它具有调理肠道中乳酸杆菌的作用。张海波等通过实时PCR技术对新生儿粪便中的双歧杆菌属、乳酸杆菌属进行定量检测,发现剖宫产组的粪便标本中乳酸杆菌数量低于自然分娩组。

定量乳酸杆菌属含量常用的方法是荧光实时定量PCR。然而,近几年,数字PCR凭借不依赖扩增曲线的Ct (循环阈值)、不受扩增效率影响、也不必采用内参基因和标准曲线等特点,成为了新一代绝对定量PCR的代表,其中尤以微滴式数字PCR应用较广。但是,无论荧光实时定量PCR还是微滴式数字PCR,都离不开引物。理想的定量结果往往取决于引物的特异性,因此特异性较好的引物是定量成功的必要基础。理论上符合引物设计原则就能设计出理想的引物,实际上,不论是理论上绝对特异还是试验绝对特异,都很难设计出绝对完美的“引物”。参考已有的引物,往往不能达到预期的特异性,而且引物质量参差不齐、特异性有待商榷,而设计引物必须经过大量试验进行特异性验证,费时费力,也不能保证引物的特异性。

本文通过查阅文献筛选出12对乳酸杆菌属或包含乳酸杆菌属的引物,根据文中提到的退火温度进行PCR,用琼脂糖凝胶电泳进行特异性检验,结果发现12对引物的特异性均不理想,因此,本文利用MEGA 6.0、Primer 5.0软件和NCBI网站BLAST软件对12对乳酸杆菌属引物的特异性和自身质量进行评估,以评估结果为依据进行理论筛选、组合和调整,获得理论特异性较好且符合乳酸杆菌属定量的引物组合,之后对新组合的引物进行特异性检验,筛选出特异性较好的乳酸杆菌属引物。最后借助微滴式数字PCR,用筛选好的引物对一份已知含有乳酸杆菌的粪便样品进行定量,通过先理论、后试验的方法,筛选出了一对乳酸杆菌属特异性引物,同时为快速筛选适宜的、特异性较好的引物提供理论依据。

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